Fundación española y época virreinal
Los conquistadores españoles supieron desde su llegada a lo que es hoy territorio peruano, que su meta era tomar la ciudad del Cusco, capital del imperio.
Luego de capturar al inca Atahualpa en Cajamarca, iniciaron su marcha hacia el Cusco. En el camino fundaron algunas ciudades como enlace entre la capital del Imperio y la pionera ciudad de San Miguel de Tangarará. El 23 de marzo de 1534, Francisco Pizarro fundó a la usanza española la ciudad del Cusco, estableciendo como Plaza de Armas la ubicación que aún mantiene la ciudad moderna y que era también la plaza principal durante el incanato y que se encontraba rodeada de los palacios de quienes fueron los soberanos incas. En el solar que da al norte se inició la construcción de la catedral. Pizarro otorgó a la ciudad la denominación de Cuzco, Ciudad Noble y Grande.
Los sobrevivientes del Imperio incaico mantuvieron una lucha durante los primeros años de la colonia. En 1536 Manco Inca inició sus enfrentamientos y creó la dinastía de los Incas de Vilcabamba. Esta dinastía encontró su fin en 1572 cuando el último inca Túpac Amaru I fue derrotado, capturado y decapitado.
La ciudad se convirtió en un importante centro comercial y cultural de los Andes centrales ya que se encontraba en las rutas entre Lima y Buenos Aires. Sin embargo, la administración virreinal prefirió la ubicación de Lima (fundada un año después que Cusco en 1535) y principalmente la cercanía de ésta con el puerto natural de lo que sería el Callao para establecer la cabecera de sus dominios en Sudamérica. La ciudad ya es mencionada en el primer mapa conocido sobre el Perú.
Cusco fue tomada como cabecera de la administración virreinal en el sur del país, siendo en sus inicios la ubicación de más importancia en detrimento de las ciudades recientemente fundadas de Arequipa o Moquegua. Su población era principalmente de indígenas pertenecientes a la aristocracia incaica a quienes se les respetó algunos de sus fueros y privilegios. También se radicaron un buen número de españoles. En esa época inició el proceso de mestizaje cultural que hoy marca a la ciudad.
El desarrollo urbano se vio interrumpido por varios terremotos que en más de una ocasión destrozaron la ciudad. En 1650 un terremoto violento destruyó casi todos los edificios coloniales. Durante este terremoto obtuvo gran importancia la efigie del Señor de los Temblores que aún hoy es sacado anualmente en procesión.
En 1780 la ciudad del Cusco se vio convulsionada por el movimiento iniciado por el cacique José Gabriel Condorcanqui, Túpac Amaru II que se levantó contra la administración española. Su levantamiento fue sofocado tras varios meses de lucha en los que puso en jaque a las autoridades virreinales apostadas en el Cusco. Túpac Amaru fue vencido, tomado prisionero y ejecutado junto a toda su familia en la Plaza de Armas del Cusco. Aún hoy subsiste, al costado de la Iglesia de la Compañía de Jesús la capilla que sirvió de prisión al prócer. Este movimiento se expandió rápidamente por todos los Andes y marcó el inicio del proceso emancipador sudamericano.
En 1814 otro levantamiento en contra de la administración virreinal tuvo lugar en el Cusco. El brigadier Mateo Pumacahua, mestizo cusqueño quien había enfrentado a las fuerzas de Túpac Amaru II, inició la Rebelión del Cusco junto con los hermanos Angulo para lograr la independencia del Perú. Este levantamiento también fue sofocado.